Вступ до принципу та застосування загальних компонентів спектрофотометра

Спектрофотометр широко застосовується в біологічних, хімічних, клінічних та екологічних дослідженнях.
Спектрофотометрія вимірює, скільки світла хімікал може поглинати, пропускаючи промінь світла через зразок в спектрофотометрі.
Вимірюючи виявлену інтенсивність світла, метод може бути використаний для визначення концентрації розчиненого речовини в зразку.
Поняття спектрофотометрії
Промінь, що направляється на зразок, складається з фотонного променя.
Коли фотони зустрічаються з молекулами у зразку, молекули можуть поглинати деякі з них, зменшувати кількість фотонів у пучку і зменшувати інтенсивність сигналу виявлення.
Пропускання - це частина світла, що проходить через зразок. Він визначається як інтенсивність світла, що проходить через зразок при інтенсивності падаючого світла.
Поглинання протилежно пропусканню, що відповідає величині, виміряній спектрофотометром.
Відповідно до поглинання концентрацію зразка розчину можна визначити із законопроекту Ламберта, який показує, що між поглинанням та концентрацією зразка існує лінійна залежність. Відповідно до закону Ламберта з пивом, поглинання - це добуток коефіцієнта поглинання, який є мірою кількості світла, поглиненого розчиненим речовин при заданій довжині хвилі, і відстані, через яке проходить світло. Відбір проби або відстань у дорозі та концентрація розчинених речовин. Загалом метою вимірювання поглинання є вимірювання концентрації зразка.
Компоненти спектрофотометра
Кожен спектрофотометр складається з джерела світла, коліматора (лінзи або фокусуючого пристрою для передачі сильних і прямих променів), монохроматора для розділення пучків різної довжини хвилі та селектора довжини для вибору хвилі або канавки потрібної довжини хвилі. Довжина хвилі світла, що використовується на спектрофотометрі, представленому у цьому відео, знаходиться в діапазоні ультрафіолетового та видимого світла. Спектрофотометр також включає держатель зразка, фотодетектор і екран, що відображає результати детектора.
Найновіший спектрофотометр безпосередньо пов'язаний з комп'ютером, де можна контролювати експериментальні параметри та відображати результати.
Принцип роботи спектрофотометра
Виконуючи спектрофотометрію, важливо вживати відповідних запобіжних заходів, наприклад, носити рукавички, залежно від типу біологічного чи хімічного розчину, який ви використовуєте.
Увімкніть прилад і дозвольте лампі та електроніці нагріватися перед вимірюванням спектра ультрафіолетового зразка.
Підготуйте порожній зразок того ж розчину з тим самим рН та схожою іонною силою, але без аналізованих компонентів; оскільки кювета та розчинник можуть розповсюджувати світло, необхідно проаналізувати зразок.
Традиційний тримач для зразків спектрофотометра призначений для вміщення пластикових та кварцових чаш. Піпетку відправте в миску.
Витираючи відбитки пальців і бризок їх на зовнішню сторону чаші, правильно вставити кюветку в тримач для зразків і закрити кришку.
Ніколи не забудьте закрити двері, тому що УФ-випромінювання відкритого спектрофотометра може пошкодити очі та шкіру.
Запрограмуйте бажану довжину хвилі або діапазон довжин хвиль, які будуть передані вибірці. Це залежить від найкращої довжини хвилі, яку може поглинати компонент, що аналізується. Потім машина занулюється шляхом вимірювання порожнього зразка, який віднімає нижню абсорбцію за рахунок буфера зразка.
Залежно від типу експерименту спектрофотометрії, який ви робите, може бути необхідним створити стандартну криву перед вимірюванням зразка, з якої можна визначити концентрацію з'єднання, що аналізується у зразку.
Дозвольте зразку досягти належної температури і обережно перемішайте, щоб уникнути пухирців. Потім зразок може бути доданий безпосередньо в чашу всередині машини, і можна зробити зчитування.
Після того, як зразок був виміряний на поглинання, експеримент належним чином розраховується; наприклад, для визначення концентрації або рівня активності ферменту.
Застосування спектрофотометра
Одне з поширених застосувань спектрофотометра - це вимірювання щільності клітин. Вимірювання клітинної щільності можна використовувати для отримання логарифмічної кривої росту бактерій, з якої можна визначити оптимальний час для інтеграції рекомбінантного білка.
Спектрофотометр також може бути використаний для вимірювання швидкості хімічної реакції. У цьому варіанті втілення абсорбція використовується для контролю ферментативної реакції, яка з часом зникає через проміжну реакцію 452 нм. Швидкість цього ферментативного кроку може бути обчислена шляхом зіставлення даних з відповідним рівнянням.
Введення мікроспектрофотометра виключає потребу у власника зразка. Ці спектрофотометри використовують поверхневий натяг для підтримки зразка.
Мікроспектрофотометр - найкращий вибір для вимірювання маси та концентрації невеликих і дорогих зразків, таких як біомолекули, включаючи білки та нуклеїнові кислоти.
Поглинання білків при 280 нм залежить від вмісту ароматичних бічних ланцюгів, які містяться в триптофані, тирозині та фенілаланіні, а також дисульфідного зв’язку між цистеїнами.
Концентрацію білка можна визначити за його абсорбції при 280 нм та коефіцієнтом його поглинання, який базується на складі амінокислот.
ДНК і РНК мають максимальну абсорбцію при 260 нм, з якої можна визначити їх концентрацію. Чистоту нуклеїнових кислот можна також оцінити з відношення показань поглинання до конкретних довжин хвиль.