Спектрофотометри стали рутинними інструментами в сучасних лабораторіях молекулярної біології. Часто використовується для нуклеїнової кислоти, кількісного визначення білка та кількісного визначення концентрацій росту бактерій.
Простий принцип спектрофотометра
Спектрофотометр використовує джерело світла, яке може генерувати декілька довжин хвиль, і проходить через серію спектроскопічних пристроїв для генерації джерела світла певної довжини хвилі. Після того, як джерело світла проходить через зразок, який підлягає випробуванню, частина джерела світла поглинається, і поглинання зразка обчислюється, тим самим перетворюючись у концентрацію проби. . Поглинання зразка пропорційне концентрації проби.
Кількісне визначення нуклеїнових кислот
Кількісне визначення нуклеїнових кислот є найбільш часто використовуваною функцією спектрофотометра. Олігонуклеотиди, одноланцюгові, дволанцюгові ДНК та РНК можуть бути кількісно визначені в буфері. Пік поглинання найвищого піку поглинання нуклеїнової кислоти становить 260 нм. Молекулярний склад кожної нуклеїнової кислоти різний, тому коефіцієнти перетворення різні. Для кількісної оцінки різних типів нуклеїнових кислот заздалегідь виберіть відповідні коефіцієнти. Наприклад, абсорбція 1 OD відповідає 50 мкг / мл dsDNA, 37 мкг / мл ssDNA, 40 мкг / мл РНК і 30 мкг / мл Olig. Поглинання після випробування перетворюється за вказаними вище коефіцієнтами для отримання відповідної концентрації зразка. Перед тестуванням виберіть правильну процедуру, введіть об’єм вихідного розчину та розріджувача, а потім випробуйте розчин для проби та зразок. Однак експеримент не завжди був гладким. Нестабільні показання можуть бути найбільшим головним болем для експериментатора. Прилади з більшою чутливістю демонструють більший дрейф поглинання.
Насправді принцип проектування та принцип роботи спектрофотометра дозволяють змінювати поглинання в певному діапазоні, тобто прилад має певну точність і точність. Наприклад, точність біофотометра Еппендорфа становить ≤1% (1А). Результати таких багаторазових тестів коливаються приблизно від 1,0% від середнього і є нормальними. Крім того, необхідно також враховувати фізико-хімічні властивості самої нуклеїнової кислоти та рН буфера, в якому розчинена нуклеїнова кислота, концентрацію іонів тощо: Коли концентрація іонів занадто висока під час випробування, зчитування зсуву, тому рекомендується використовувати певне значення рН та низьку концентрацію іонів. Буфери, такі як ТЕ, значно стабілізують показання. Концентрація розведення зразка також є фактором, який не можна ігнорувати: через неминучу присутність у пробі деяких дрібних частинок, особливо зразків нуклеїнової кислоти. Наявність цих дрібних частинок перешкоджає результатам випробувань. Щоб мінімізувати вплив частинок на результати випробувань, абсорбція нуклеїнової кислоти повинна бути щонайменше більшою, ніж 0,1 А, а поглинання переважно становить від 0,1 до 1,5 А. У межах цього діапазону інтерференція частинок порівняно мало і результат стабільний.
Це означає, що концентрація зразка не повинна бути занадто низькою або занадто високою (за межами тестового діапазону фотометра). Нарешті, робочих факторів, таких як змішування, повинно бути достатнім, інакше значення поглинання занадто низьке, навіть негативні значення; суміш не може існувати бульбашок, порожня рідина не має зваженої речовини, інакше читання різко дрейфує; таку ж кювету потрібно використовувати для тестування заготовки та зразка. В іншому випадку різниця в концентрації занадто велика; коефіцієнт перетворення та одиниця концентрації вибірки вибираються послідовно; кювета з віконним зносом не можна використовувати; об'єм зразка повинен досягати мінімального обсягу, необхідного кюветі.
На додаток до концентрації нуклеїнової кислоти, спектрофотометр також показує кілька дуже важливих співвідношень, що вказують на чистоту зразка, такі як співвідношення A 260 / A 280, яке використовується для оцінки чистоти зразка, оскільки пік поглинання білка становить 280 нм. Чистий зразок із співвідношенням більше 1,8 (ДНК) або 2,0 (РНК). Якщо відношення нижче 1,8 або 2,0, це вказує на наявність білка або фенольних речовин. А 230 означає, що в зразку присутні деякі забруднювачі, такі як вуглеводи, пептиди, феноли тощо, а відношення до чистої нуклеїнової кислоти A 260 / A 230 перевищує 2,0. 320 визначає помутніння розчину та інші фактори перешкод. Для чистих зразків A 320, як правило, дорівнює 0.
Ханчжоу Sumer інструмент Co., ТОВ
Додати: No.168 Wuchang Ave., район Yuhang, 310023 Ханчжоу, Китай
ТЕЛЬ: + 86-571-88739859
Телефон: +8618658504900
Електронна пошта: info@sumerlab.com
Веб: sumerinstrument.com